Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
с) Метод последовательных отборов
Применение данного метода описывают в частной статье.
2.2.29. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Жидкостная хроматография (ЖХ) представляет собой метод разделения, в котором подвижной фазой является жидкость, а неподвижной фазой, помещенной в колонку, является тонкодисперсное твердое вещество или жидкость, нанесенная на твердый тонкодисперсный носитель, или химически модифицированный тонкодисперсный носитель посредством введения органических групп.
Жидкостная хроматография основана на механизмах адсорбции, распределения, ионного обмена или разделения по размерам молекул.
Оборудование. Оборудование обычно состоит из системы подачи подвижной фазы, устройства ввода пробы (с использованием автосамплера или петлевого дозатора), хроматографической колонки, детектора, дегазатора и регистрирующего устройства. Подвижная фаза обычно подается под давлением из одной или нескольких емкостей и протекает через устройство ввода пробы, колонку, а затем через детектор с заданной скоростью.
Температуру хроматографической колонки поддерживают постоянной. Состав подвижной фазы, в зависимости от указанного в частной статье, может или оставаться постоянным на протяжении всего анализа (изократическое элюирование), или может изменяться в соответствии с задаваемой программой (градиентное элюирование).
Используемый детектор должен обеспечивать определение тех количеств анализируемых веществ, которые элюируются из колонки. Обычно для детектирования используют абсорбционную спектрофотометрию, а также дифференциальную рефрактометрию, флуориметрию, сжигание и электрохимические методы.
Методика. Колонку уравновешивают при указанном составе подвижной фазы. Готовят испытуемый раствор и раствор(ы) сравнения, как указано в частной статье. Растворы не должны содержать твердых частиц. Используя растворы сравнения, настраивают прибор и подбирают объемы вводимых проб, которые позволяют получить необходимый (адекватный) сигнал. Выполняют повторные введения для проверки сходимости сигнала и проверяют, если необходимо, число теоретических тарелок.
Вводят растворы и регистрируют результаты хроматографирования. Для проверки сходимости сигнала выполняют повторные введения. Определяют площади пиков анализируемых компонентов. В случае, если коэффициент асимметрии, вычисленный, как описано ниже, имеет значение от 0.8 до 1.20, допускается проводить определение по высоте пиков. При использовании градиентного элюирования необходимо проводить определение по площадям пиков. При использовании внутреннего стандарта следует удостовериться, что ни один из пиков анализируемого вещества или его примеси не маскируется пиком внутреннего стандарта.
Из полученных значений вычисляют содержание определяемого компонента или компонентов. Если указано в частной статье, процентное содержание одного или нескольких компонентов анализируемой пробы определяют посредством вычисления процентной доли площади соответствующего пика или пиков к суммарной площади всех пиков, исключая пики растворителей или добавленных реактивов (метод внутренней нормализации). В этих случаях рекомендуется использование широкодиапазонного усилителя и автоматического интегратора.
# КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Абсолютная градуировка. Если нет других указаний в частной статье, испытуемый раствор и раствор сравнения попеременно хроматографируют на жидкостном хроматографе, получая не менее пяти хроматограмм, в условиях, указанных в частной статье. Для испытуемого раствора и раствора сравнения рассчитывают средние значения площадей или высот пиков анализируемого вещества. По полученным средним значениям рассчитывают концентрацию анализируемого вещества в испытуемом растворе.
Метод внутреннего стандарта. Для каждой хроматограммы сначала рассчитывают отношение площади или высоты пика анализируемого вещества к площади или высоте пика внутреннего стандарта. Полученные отношения усредняют для испытуемого раствора и раствора сравнения и по найденным средним значениям определяют концентрацию анализируемого вещества в испытуемом растворе.
# КОНТРОЛЬ ПРИМЕСЕЙ
Для контроля примесей обычно используют следующие подходы.
1. Количественное определение примеси с использованием раствора сравнения с известной концентрацией примеси (обычно в методе абсолютной калибровки). Такой подход предполагает одинаковый сигнал примеси в присутствии и в отсутствии основного вещества.
2. Метод внутренней нормализации. Такой подход предполагает выполнение линейности в широком диапазоне и может потребовать учета различий в чувствительности детектора по отношению к примеси и основному веществу. Его часто применяют для определения суммы примесей. При этом сумму площадей всех пиков на хроматограмме (без учета пика растворителя) принимают за 100% и содержание каждой конкретной примеси или суммы примесей находят как долю площади пика этой примеси или суммы площадей пиков примесей в общей сумме площадей всех пиков на хроматограмме.
